Bidirektionale Veränderungen der Gehirntemperatur modulieren die räumlich-zeitlichen neurovaskulären Reaktionen tiefgreifend

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 185 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Neurovaskuläre Kopplung (NVC) ist ein Mechanismus, der neben anderen bekannten und latent kritischen Funktionen dafür sorgt, dass aktivierte Gehirnregionen ausreichend mit Sauerstoff und Glukose versorgt werden. Dieses biologische Phänomen liegt den nicht-invasiven perfusionsbezogenen Neuroimaging-Techniken zugrunde, und aktuelle Berichte haben eine NVC-Beeinträchtigung bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Dennoch bleibt noch viel Unbekanntes über NVC bei Gesundheit und Krankheit, und erst in jüngster Zeit wurde zunehmend erkannt, dass eine enge Wechselwirkung mit der Thermodynamik des Gehirns besteht. Dementsprechend haben wir einen neuartigen multimodalen Ansatz entwickelt, um die kortikale Temperatur systematisch zu modulieren und die raumzeitliche Dynamik sensorisch hervorgerufener NVC zu untersuchen. Wir zeigen, dass Änderungen der kortikalen Temperatur die NVC tiefgreifend und komplex modulieren, wobei niedrige Temperaturen mit einer verminderten Sauerstoffzufuhr einhergehen und hohe Temperaturen eine deutliche Gefäßoszillation auslösen. Diese Beobachtungen liefern neue Einblicke in die Beziehung zwischen NVC und der Thermodynamik des Gehirns, mit wichtigen Implikationen für Therapien im Zusammenhang mit der Gehirntemperatur, funktionellen Biomarkern erhöhter Gehirntemperatur und In-vivo-Methoden zur Untersuchung der neurovaskulären Kopplung.

Die neurovaskuläre Kopplung ist ein lebenswichtiger homöostatischer Mechanismus, der zahlreiche wichtige Funktionen im gesunden Gehirn erfüllt, darunter die Zufuhr von Sauerstoff und Glukose zu aktivierten Regionen, die Beseitigung von Abfallstoffen und Stoffwechselnebenprodukten, den Neuroimmuntransport und die Regulierung der Gehirntemperatur1. Die erhaltene neurovaskuläre Kopplung ist eine grundlegende Annahme, die den Rückschluss auf die neuronale Aktivierung aus perfusionsbezogenen Neuroimaging-Signalen, wie z. B. der blutsauerstoffgehaltsabhängigen (BOLD) funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRT)2, untermauert. Die beeinträchtigte neurovaskuläre Kopplung wiederum hat in letzter Zeit besonderes Interesse geweckt. Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass Defizite eine Schlüsselrolle beim Fortschreiten und möglicherweise bei der Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit spielen3,4,5 und unterstreichen das Potenzial der neurovaskulären Kopplung Einheitsdefizite als neue Ziele für die Therapie und empfindliche Biomarker für frühe Erkrankungen.

Die Gehirntemperatur wird durch ein komplexes Zusammenspiel zwischen Gehirnstoffwechsel, Blutfluss und Körperkerntemperatur reguliert, sodass bei gesunden Menschen die Wärmeproduktion in aktivierten Gehirnregionen aufgrund einer erhöhten Stoffwechselrate durch den Zufluss von Blut mit Kerntemperatur während der Funktion abgebaut wird Hyperämie6,7. Pathologische Veränderungen der Gehirntemperatur hingegen werden zunehmend als wichtiges Merkmal bei verschiedenen Erkrankungen erkannt, darunter neurodegenerative Erkrankungen, Epilepsie, Hirnverletzungen und Schlaganfall 8,9. Der altersabhängige Rückgang des Gehirnstoffwechsels ist mit einer gleichzeitigen Verringerung der Gehirntemperatur verbunden10, und eine verringerte Gehirntemperatur bei Parkinson-Patienten wurde auf eine beeinträchtigte mitochondriale Biogenese11,12 zurückgeführt, wobei Personen mit mitochondrialer Erkrankung aufgrund einer fehlerhaften oxidativen Phosphorylierung eine zerebrale Hypothermie aufwiesen13 . Fieber (Pyrexie) nach einem Schlaganfall ist auch mit einem Anstieg der Morbidität und Mortalität verbunden14 und wird häufig nach traumatischen Hirnverletzungen beobachtet15 und ist mit einer erhöhten neurologischen Schwere und Verweildauer auf Intensivstationen verbunden16. Während der Anfallsaktivität wird gleichzeitig ein Anstieg der Gehirntemperatur beobachtet17,18 und fieberinduzierte Anfälle sind die häufigste pathologische Gehirnaktivität während der Entwicklung, wobei eine unverhältnismäßig große Anzahl erwachsener Patienten mit medialer Temporallappenepilepsie im Kindesalter Fieberanfälle erlitten hat19,20. Diese und andere Berichte haben in jüngster Zeit zu einem erheblichen Interesse an der Manipulation der Gehirntemperatur als therapeutische Strategie zur Verbesserung der Ergebnisse neurologischer Erkrankungen geführt, obwohl klinische Studien gemischte Erfolge gemeldet haben, möglicherweise aufgrund eines mangelnden Konsenses über optimale Interventionsprotokolle21,22,23 ,24. Zwar gibt es erhebliche Belege dafür, dass Änderungen der Gehirntemperatur gefäßassoziierte Reaktionen verändern, wie z. B. die Affinität von Hämoglobin zu Sauerstoff (und damit die Sauerstoffsättigung des Blutes)7, die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke25 und den zerebralen Blutfluss sowie die neurometabolischen Raten18, Über den Einfluss der Gehirntemperatur auf die räumlich-zeitliche Entwicklung der neurovaskulären Kopplung ist nur sehr wenig bekannt. Die Schließung dieser wichtigen Forschungslücke ist von entscheidender Bedeutung, um (1) aufzuklären, wie pathologische Veränderungen der Gehirntemperatur negative klinische Ergebnisse bei einer Vielzahl von Hirnerkrankungen verschlimmern, (2) rationale und wirksame Therapieansätze auf der Grundlage der Modulation der Gehirntemperatur zu entwickeln und (3) eine zu ermöglichen Präzisere Interpretation von BOLD fMRI-bezogenen Signalen im Hinblick auf die zugrunde liegende neuronale Aktivierung bei Gesundheit und Krankheit.

Dementsprechend wollten wir hier systematisch untersuchen, wie sich bidirektionale (d. h. hypo- und hyperthermische) Modulation der Gehirntemperatur auf die neurovaskuläre Kopplung auswirkt, und die Hypothese testen, dass solche Veränderungen die Beziehung zwischen evozierter neuronaler Aktivität und Hämodynamik, insbesondere der zeitlichen, dynamisch verändern würden Entwicklung beider Variablen und der Dynamik von funktioneller Hyperämie und Auswaschung. Zu diesem Zweck führten wir gleichzeitige multimodale Messungen der laminaren neuronalen Aktivität, der sauerstoffreichen und sauerstoffarmen Hämoglobinkonzentration, der Sauerstoffversorgung und -temperatur des Gewebes sowie eine abgestufte Modulation der lokalen Gehirntemperatur durch. Unter Verwendung des gut charakterisierten somatosensorischen Kortex der Ratte als Modellsystem zeigen wir, dass eine fortschreitende Abkühlung des Gehirns zu einer erhöhten Verzögerung beim Einsetzen der neurovaskulären Kopplung und einer stärkeren Bedeutung eines robusten vorübergehenden Anstiegs des Desoxyhämoglobins („Desoxy-Dip“) während genau definierter Zeiträume führt Whisker-Stimulation. Umgekehrt stellten wir fest, dass erhöhte kortikale Temperaturen mit der Entstehung einer pathologischen niederfrequenten Oszillation verbunden waren. Zusammen mit der Feststellung einer umgekehrten U-förmigen Beziehung zwischen modulierter Temperatur und der Größe der hervorgerufenen neuronalen Aktivität und Hämodynamik (und Kopplung) liefern diese Daten somit wichtige Einblicke in den Zusammenhang zwischen neurovaskulärer Kopplung und Gehirnthermodynamik und haben wichtige Implikationen für unser Verständnis über die Rolle der Gehirntemperatur bei pathogenen Prozessen nach Ereignissen wie Schlaganfall, Hirnverletzung und Krampfanfällen und ihren potenziellen Wert als Ziel für Therapie und Diagnose26.

Wir verwendeten eine neuartige Methode zur Feinsteuerung der kortikalen Temperatur (Abb. 1a, siehe Methoden) sowie eine multimodale Messung der kortikalen Hämodynamik, der laminaren Nervenaktivität, der Temperatur und der Sauerstoffversorgung des Gewebes (Abb. 1b, siehe Methoden). Unser Temperaturmodulationsansatz unter Verwendung einer am Schädel befestigten Kammer und Spule ergab stabile und linear verwandte Änderungen der kortikalen Grundtemperatur (Abb. 1c) und induzierte erwartete Schwankungen der Grundlinien-Gewebeoxygenierung (pO2) in Form einer nichtlinearen Monotonie zunehmende Beziehung (Abb. 1d und siehe auch Ergänzungstabellen 1, 2). Die beobachtete Abnahme des pO2 bei sinkender Gehirntemperatur tritt auf, obwohl die Sauerstoffsättigung des Blutes gleichzeitig zunimmt (wie durch Basisspektroskopieberechnungen im Abschnitt „Methoden“ gezeigt), da eine Senkung der Gehirntemperatur die Affinität von Hämoglobin zu Sauerstoff erhöht27. Darüber hinaus war unsere Methodik in der Lage, kleine, aber statistisch signifikante Änderungen der evozierten kortikalen Temperatur nach 2 s und 16 s Whisker-Stimulation während der Modulation der kortikalen Temperatur zu erkennen (Einzelfaktor-ANOVA, 2 s, Ergebnisse F = 9,93, p = 2,9 × 10- 6, 16 s, F = 33,45, p = 6,7 × 10-9). Bemerkenswert ist, dass zwischen den Grundlinien eine umgekehrte U-förmige Beziehung (der Form y = a + bx + cx2, Kurvenanpassung mithilfe nichtlinearer kleinster Quadrate, Anpassungsgüte 2 s, 0,9; 16 s, 0,86) beobachtet wurde und durch Reize hervorgerufene Veränderungen der kortikalen Temperatur (Abb. 1e). Dieser Zusammenhang deutete darauf hin, dass der Zufluss von Blut mit Kerntemperatur während der funktionellen Hyperämie einen kühlenden Effekt im Kortex erzeugte, wenn die kortikale Temperatur die des Kerns überstieg (bei ~37 °C unter Verwendung einer homöothermischen Decke gehalten), was durch einen ay = 0-Kreuzung bei 37,6 ± angezeigt wird 0,19 °C (Abb. 1e, gepoolte Stimulationsbedingungen) und ein gegenläufiger Erwärmungseffekt, wenn die kortikale Temperatur relativ zum Kern verringert wurde. Diese Ergebnisse zeigen die effektive Manipulation der Gehirntemperatur mithilfe unserer Methodik, die die anschließende Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Gehirntemperatur und sensorisch hervorgerufenen neuronalen und vaskulären Reaktionen ermöglichte.

ein Schema des kortikalen Kühlansatzes unter Verwendung computergestützter proportionaler Integration und Differenzierung (PID) zur thermischen Manipulation kortikaler Regionen. b Digitale Bilder der kortikalen Oberfläche, die die Positionierung der Mehrkanalelektrode und der Multisensor-Gewebeoxygenierungs- und Temperatursonde im Whisker-Barrel-Cortex (oben) und die Identifizierung der wichtigsten Oberflächenarterien und -venen (unten) veranschaulichen. c Die Manipulation der kortikalen Temperatur mithilfe einer am Schädel befestigten Fluidkammer führte zu zuverlässigen und stabilen Veränderungen der kortikalen Temperatur. d Änderungen der kortikalen Temperatur veränderten kanonisch die Grundsauerstoffversorgung des Gewebes aufgrund von Änderungen in der Affinität von Hämoglobin zu Sauerstoff. e 2 s und 16 s lange Whisker-Stimulation induzierte Veränderungen der kortikalen Temperatur, die als Funktion der kortikalen Grundtemperatur variierten, so dass der Zufluss von Blut mit funktioneller Hyperämie einen Kühleffekt hervorrief, wenn die kortikale Temperatur über der Kerntemperatur (~37 °C) lag, und die entgegengesetzter Erwärmungseffekt, wenn die kortikale Grundtemperatur unter der Kerntemperatur lag. c–e Offene Kreise kennzeichnen individuelle Tierdaten, wobei jede Farbe jede modulierte Temperaturbedingung darstellt. Gefüllte Rauten derselben Farbe geben den Durchschnitt aller Tiere an. Gestrichelte graue Linien kennzeichnen 95 %-Konfidenzgrenzen der Kurvenanpassung (hellblau in c und d, durchgehend grau in e) an gemittelte Daten. Informationen zur Kurvenanpassung und zu statistischen Details finden Sie im Haupttext.

Die Reaktionen des evozierten lokalen Feldpotentials (LFP) auf eine 2- und 16-sekündige Whisker-Stimulation während der kortikalen Temperaturmanipulation wurden gemittelt, um eine mittlere Impulsantwort über die von der Mehrkanalelektrode überspannte Tiefe von 1500 µm zu erzeugen (Abb. 2a). Nach der Extraktion von Stimulations-LFP-Zeitreihen aus körnigen Schichten (400–900 µm) wurde festgestellt, dass die systematische Modulation der kortikalen Temperatur die Amplitude der hervorgerufenen negativen LFP-Ablenkung signifikant beeinflusst (Einzelfaktor-ANOVA, 2 s, F = 5,65, df = 6). , p = 0,00066; 16 s, F = 13,02, df = 6, p = 1,09 × 10−7), wobei beobachtet wurde, dass niedrigere kortikale Temperaturen mit einer relativen Verringerung der evozierten LFP-Größe und einer Verbreiterung der Reaktion im Vergleich zu verbunden sind wärmere kortikale Temperaturen (Abb. 2b, mit stärkeren Auswirkungen bei 16-s-Stimulation). Bemerkenswert ist eine auffällige umgekehrte U-förmige Beziehung (der Form y = a + bx + cx2, Kurvenanpassung unter Verwendung nichtlinearer kleinster Quadrate, Anpassungsgüte 2 s, 0,92; 16 s, 0,97) zwischen der kortikalen Grundtemperatur und Es wurde eine evozierte LFP-Amplitude beobachtet, wobei die stärkste Reaktion modelliert bei 31,5 °C (2 s) und 30,8 °C (16 s) auftrat (Abb. 2c, beachten Sie die evozierten LFP-Amplituden als absolute Werte). In ähnlicher Weise zeigte die über Stimulationsimpulse gemittelte evozierte Multi-Unit-Aktivität (MUA) deutliche vorübergehende Anstiege über die kortikalen Schichten hinweg (Abb. 2d), mit einem statistisch signifikanten Effekt der kortikalen Temperatur auf die evozierte granulare MUA-Amplitude (Einzelfaktor-ANOVA, 2 s, F = 33,38, df = 6, p = 1,17 × 10−12; 16 s, F = 43,81, df = 6, p = 7,58 × 10−15) und eine allgemeine Verbreiterung und Verringerung der Spitzenamplitude mit abnehmender kortikaler Temperatur ( Abb. 2e und umfassende Statistiken finden Sie auch in der Ergänzungstabelle 3. In Übereinstimmung mit den evozierten LFP-Beobachtungen wurde erneut festgestellt, dass die kortikale Grundtemperatur nicht linear mit der evozierten MUA-Amplitude zusammenhängt (umgekehrte U-förmige Beziehung der Form y = a + bx + cx2, Anpassungsgüte 2 s, 0,92; 16 s). , 0,98), wobei die maximalen Reaktionen modelliert bei 27,9 °C (2 s) und 28,9 °C (16 s) auftreten (Abb. 2f). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass es einen tiefgreifenden nichtlinearen Zusammenhang zwischen der kortikalen Temperatur und sensorisch hervorgerufenen neuronalen Reaktionen gibt, mit einem vorhergesagten maximalen Betriebsbereich von 29,8 ± 0,7 °C unter unseren experimentellen Bedingungen.

a Beispiel eines laminaren Profils gemittelter LFP-Reaktionen auf Whisker-Stimulation als Funktion der kortikalen Temperatur. b Mittlere evozierte LFP-Zeitreihen im granulären Kortex bis zur Whisker-Stimulation. c Nichtlineare Beziehung zwischen der kortikalen Grundtemperatur und der evozierten absoluten LFP-Amplitude. d Laminares Profil der durchschnittlichen MUA-Reaktionen auf Whisker-Stimulation als Funktion der kortikalen Temperatur. e Mittelwert evozierte MUA-Zeitreihen im granulären Kortex bis hin zur Whisker-Stimulation. f Die evozierten MUA-Reaktionen zeigten eine nichtlineare Beziehung zur kortikalen Grundtemperatur, wie in den evozierten LFP-Messungen zu sehen ist. c, f Offene Kreise kennzeichnen individuelle Tierdaten, wobei jede Farbe jede modulierte Temperaturbedingung darstellt. Gefüllte Rauten derselben Farbe geben den Durchschnitt aller Tiere an. Gestrichelte graue Linien kennzeichnen 95 %-Konfidenzgrenzen der Kurvenanpassung (hellblau) an gemittelte Daten. Informationen zur Kurvenanpassung und zu statistischen Details finden Sie im Haupttext.

Gleichzeitige räumlich-zeitliche Aufzeichnungen der Änderung der Gesamthämoglobin- (Hbt), Oxyhämoglobin- (Hbo) und Desoxyhämoglobinkonzentration (Hbr) während der 2- und 16-sekündigen Whisker-Stimulation (Abb. 3a) bei moderaten kortikalen Temperaturen (~ 29–37,5 °C) zeigten einen kanonischen Fokus Beginn (ca. 1 s nach Beginn der Stimulation) im Barrel-Cortex mit anschließender Zunahme der räumlichen Abdeckung (Abb. 3b). Im Gegensatz dazu erreichten diese bei erhöhten kortikalen Temperaturen relativ langsam ihren Höhepunkt, verringerten sich in der Amplitude und waren räumlich diffuser und waren auch interessanterweise mit der Entstehung einer anhaltenden niederfrequenten Oszillation verbunden, die sowohl in kurzen als auch in langen Stimulationsperioden vorhanden war (Abb . 3b, c, siehe Einschübe). Bei der Untersuchung als Funktion der kortikalen Temperatur wurden die Hbt-Spitzenamplitudenreaktionen auf sensorische Stimulation von 2 und 16 s signifikant durch die kortikale Temperatur beeinflusst (Einzelfaktor-ANOVA, 2 s, F = 5,48, df = 6, p = 0,0005; 16 s, F = 8,959, df = 6, p = 6 × 10−6) und zeigte eine umgekehrte U-förmige Beziehung, ähnlich der, die bei neuronalen Messungen beobachtet wird (siehe Abb. 2c, f), und die bei der Modellierung (Güte von Fit 2 s, 0,94; 16 s, 0,93) zeigte eine maximale Hbt-Reaktion bei kortikalen Temperaturen von 28,7 °C (2 s) und 27,1 °C (16 s) (Abb. 3c). Darüber hinaus modulierte die kortikale Temperatur die evozierte Hbt-Beginnzeit signifikant (Einzelfaktor-ANOVA, 2 s, F = 4,2, df = 6, p = 0,003; 16 s, F = 89,24, df = 6, p = 9,8 × 10−20). und zeigte sich als nichtlineare, monoton abnehmende Beziehung, so dass kortikale Hypothermie mit einer deutlichen Verzögerung von > 4 Sekunden im Vergleich zu Reaktionen bei erhöhten Temperaturen verbunden war (Abb. 3d). Daher waren die hervorgerufenen Hbt-Reaktionen bei kühlen kortikalen Temperaturen (12–15 °C) deutlich verzögert, hatten eine geringere Amplitude und zeigten im Vergleich zu Hbr einen überraschend frühen Konzentrationsanstieg (d. h. einen „Desoxy-Dip“), der länger anhielt als normalerweise aufgrund des Auswaschens zu erwarten wäre und bei höheren kortikalen Temperaturen beobachtet wurde (Abb. 3b, siehe Einschübe und auch Tabelle 3 für umfassende Statistiken). Statistische Analysen zeigten einen signifikanten Einfluss der Temperatur auf die Größe des „Desoxy-Dip“ (Einzelfaktor-ANOVA, 2 s, F = 7,006, df = 6, p = 7,2 × 10−5; 16 s, F = 11,63, df). = 6, p = 4,0 × 10−7, siehe auch ergänzende Tabelle 3 für umfassende Statistiken) und dies zeigte sich als insgesamt umgekehrte Beziehung, so dass die Größe des „Desoxy-Dip“ mit einer Verringerung der kortikalen Temperatur zunahm (Abb. 3e). ). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Veränderungen der Gehirntemperatur das Ausmaß und den Zeitpunkt der hämodynamischen Reaktionen während der sensorischen Verarbeitung auf überwiegend nichtlineare Weise dramatisch modulieren.

a Beispiel für räumlich-zeitliche Veränderungen von Hbt und Hbr bei einem einzelnen Tier während einer 16-sekündigen Whisker-Stimulation. b ROI extrahierte mittlere Hbt-, Hbo- und Hbr-Zeitreihen während der Whisker-Stimulation von 2 s und 16 s. Beachten Sie die mittleren Einschübe, die auf einen frühen Anstieg des Hbr („Desoxy-Dip“) bei kühlen kortikalen Temperaturen hinweisen, und die rechten Einschübe, die das Auftreten einer niederfrequenten Oszillation bei erhöhten kortikalen Temperaturen veranschaulichen. c Nichtlineare Beziehung zwischen der kortikalen Grundtemperatur und dem evozierten Hbt-Höhepunkt. d Nichtlineare, monoton abnehmende Beziehung zwischen der kortikalen Grundtemperatur und dem evozierten Hbt-Beginn. e Erhöhtes Vorhandensein eines Anstiegs des Hbr („Desoxy-Dip“) während der Whisker-Stimulation für 2 s und 16 s mit abnehmender kortikaler Temperatur. c–e Offene Kreise kennzeichnen individuelle Tierdaten, wobei jede Farbe jede modulierte Temperaturbedingung darstellt. Gefüllte Rauten derselben Farbe geben den Durchschnitt aller Tiere an. Gestrichelte graue Linien kennzeichnen 95 %-Konfidenzgrenzen der Kurvenanpassung (hellblau) an gemittelte Daten. Informationen zur Kurvenanpassung und zu statistischen Details finden Sie im Haupttext.

Eine interessante Beobachtung bei der Untersuchung hervorgerufener hämodynamischer Reaktionen als Funktion der kortikalen Temperatur war die einer deutlichen niederfrequenten Oszillation bei erhöhten Temperaturen (siehe Einschübe in Abb. 3b). Bei einer weiteren Analyse war diese Oszillation mit einem Anstieg der Signalleistung im Frequenzbereich von 0,05–0,25 Hz verbunden (Abb. 4a, b) und wurde als Funktion der modulierten kortikalen Temperatur verstärkt (Abb. 4c). Da Burst-Unterdrückungsphänomene auch bei überlappenden Frequenzen wirken und sich unter Anästhesiebedingungen wie den hier verwendeten manifestieren können, haben wir untersucht, ob eine solche Aktivität in irgendeiner Weise die beobachtete hämodynamische Oszillation bei höheren kortikalen Temperaturen unterstützen könnte. Die Berechnung des Burst-Unterdrückungsverhältnisses (BSR, siehe Methoden) in LFP-Daten zeigte einen Anstieg der Burst-Unterdrückung mit abnehmender kortikaler Temperatur, wie aus früheren Berichten über therapeutische Hypothermie zu erwarten war28 (Abb. 4d). Dennoch waren bei fünf von sechs Tieren, bei denen eine deutliche niederfrequente Oszillation bei der höchsten kortikalen Temperatur (~39 °C) beobachtet wurde, Unterschiede im BSR linear mit dem Vorhandensein der oben genannten hämodynamischen Oszillation korreliert, wenn auch mit einem positiven y- Achsenabschnitt (Abb. 4e), was darauf hindeutet (zusammen mit der Beobachtung, dass die Burst-Unterdrückung bei niedrigeren kortikalen Temperaturen nicht mit der Oszillation verbunden war), dass andere Faktoren als Burst-Unterdrückungseffekte zum Auftreten der niederfrequenten Oszillation unter Hyperthermie beitragen. Um diesen Effekt weiter zu veranschaulichen, haben wir die Maxima der Hbt-Oszillationen (Fenster ±10 s) während der ersten ~300 s jedes Experiments ausgewählt, was zu einem gemittelten hämodynamischen Versuch mit Hbt-Höhepunkt zum Zeitpunkt Null führte und der anschließend mit laminar verglichen werden konnte MUA wurde im selben Zeitfenster extrahiert. Bei der Untersuchung von Experimenten, bei denen die Burst-Unterdrückung besonders deutlich auftrat (Abb. 4f), ging den Hbt-Oszillationsmaxima etwa 2 s ein vorübergehender MUA-Anstieg in den körnigen und infragranulären kortikalen Schichten voraus, eine Verzögerung, die mit der durch Stimulation hervorgerufenen neurovaskulären Kopplung vergleichbar ist. In einem anderen Experiment, das ebenfalls eine robuste Grundlinienoszillation bei Hbt zeigte, konnten wiederum keine Veränderungen der Grundlinien-Neuronenaktivität festgestellt werden, wenn auch ohne Hinweise auf eine Burst-Unterdrückung (Abb. 4g). Diese Analyse ist zwar korrelativer Natur, lässt jedoch darauf schließen, dass die bei erhöhten kortikalen Temperaturen beobachtete niederfrequente Oszillation aus einem neuronalen unabhängigen Mechanismus hervorgehen könnte, der daher als Marker für zerebrale Hyperthermie unter Verwendung nicht-invasiver Bildgebungstechniken von Nutzen sein könnte.

eine kontinuierliche Wavelet-Transformation einer Proben-Interstimulus-Periode, in der eine niederfrequente Schwingung im Bereich von ~0,05–0,25 Hz in der Hbt-Zeitreihe deutlich erkennbar ist. b Normalisierte Schätzung des Welch-Leistungsspektrums (0,05–0,25 Hz) verketteter experimenteller Hbt-Zeitreihen (16 s Whisker-Stimulationsbedingung) über den untersuchten Bereich der kortikalen Temperaturen (siehe Legende), gemittelt über Tiere (Fehlerbalken aus Gründen der Übersichtlichkeit weggelassen, siehe Quantifizierung in c) . c Quantifizierung der normalisierten Daten in (b), summiert über Tiere (N = 6), was auf einen Leistungsanstieg im Frequenzbereich 0,05–0,25 Hz mit zunehmender kortikaler Temperatur hinweist. d Es wurde festgestellt, dass das Burst Suppression Ratio (BSR) bei Tieren (N = 6), ein Maß für die Prävalenz von Burst Suppression-Phänomenen in LFP-Zeitreihen, bei kühleren kortikalen Temperaturen am höchsten ist (im Einklang mit früheren Berichten) und mit zunehmender kortikaler Temperatur abnimmt . Es wurde festgestellt, dass e BSR und normalisierte Leistung im Frequenzbereich, der mit der beobachteten niederfrequenten Oszillation bei der höchsten untersuchten kortikalen Temperatur verbunden ist, bei 5/6 Tieren, die Burst-Unterdrückung zeigten, stark korrelierten, wenn auch mit einem positiven Y-Achsen-Achsenabschnitt. Dies legt nahe, dass die Burst-Unterdrückung nicht allein die Entstehung der pathologischen Oszillation unterstützt. f, g Bestätigung der Interpretation von (e) in zwei kontrastierenden Beispieltieren, bei denen sich die pathologische Oszillation in der Anwesenheit (e) und Abwesenheit (f) einer Burst-Unterdrückung manifestiert, wobei ersteres mit einem Anstieg der infragranulären MUA bei physiologischen Bedingungen verbunden ist Zeitskalen für die neurovaskuläre Kopplung.

Als nächstes untersuchten wir durch Reize hervorgerufene Veränderungen der Gewebesauerstoffversorgung (pO2) und wie diese mit gleichzeitigen hämodynamischen Messungen zusammenhängen. Wir fanden heraus, dass zwischen der kortikalen Grundtemperatur eine nichtlineare Beziehung besteht (wiederum gut gekennzeichnet durch eine umgekehrte U-förmige Funktion der Form y = a + bx + cx2, Anpassungsgüte 2 s, 0,82; 16 s, 0,89). und evozierte Veränderungen des pO2 (Abb. 5a), wobei kortikale Temperaturen unter 15,6 ± 0,3 °C (gepoolte Stimulationsbedingungen) mit einem Abfall des evozierten pO2 unter den Ausgangswert verbunden sind, was auf eine vorübergehende Hypoxie während der sensorischen Stimulation hinweist (siehe schattierte Bereiche in Abb. 5a). ). Diese Beobachtung stimmte mit einer engen negativen Korrelation (r ≤ −0,82, p ≤ 0,02, beide Stimulationsbedingungen) zwischen dem evozierten pO2 und der Spitzengröße des Hbr-Desoxyabfalls überein, sodass eine vorübergehende evozierte Hypoxie bei niedrigen kortikalen Temperaturen damit verbunden war mit einem Anstieg der evozierten Hbr-Konzentration (Abb. 5b). Darüber hinaus korrelierte der evozierte pO2 auch negativ mit dem Einsetzen des evozierten Hbt (r ≤ −0,86, p = 0,01, beide Stimulationsbedingungen), wobei eine vorübergehende evozierte Hypoxie bei niedrigen kortikalen Temperaturen mit einer erhöhten Verzögerung (2–3 s) verbunden war. im Hbt-Beginn im Vergleich zu wärmeren kortikalen Temperaturen (Abb. 5c). Schließlich untersuchten wir die neurovaskuläre Kopplung während der Manipulation der kortikalen Temperatur durch Vergleich der durch Spitzen hervorgerufenen LFP- und Hbt-Reaktionen auf die Whisker-Stimulation von 2 s und 16 s (Abb. 5d). Dies deutete auf eine nichtlineare Beziehung hin (wiederum gut gekennzeichnet durch eine umgekehrte U-förmige Funktion der Form y = a + bx + cx2, Anpassungsgüte 2 s, 0,93; 16 s, 0,95), so dass niedrigere kortikale Temperaturen damit verbunden waren mit einem steileren Anstieg der evozierten LFP-Aktivität im Vergleich zu Hbt im Gegensatz zu wärmeren kortikalen Temperaturen (Abb. 5d). Zusammengenommen deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass Änderungen der kortikalen Temperatur den Zeitpunkt und das Ausmaß der hervorgerufenen funktionellen hyperämischen Reaktionen tiefgreifend beeinflussen, wobei insbesondere eine Abkühlung des Gehirns unter ~15 °C dazu führt, dass dem Gewebe Sauerstoff vor der Vasodilatation entzogen wird, was zu transientem Gewebe führt Hypoxie, die zu einem starken frühen Anstieg des Hbr führt (dh dem „Desoxy-Dip“).

a Nichtlineare Beziehung zwischen Änderungen der evozierten Sauerstoffversorgung des Gewebes als Funktion der kortikalen Temperatur bei 2-s- und 16-s-Whisker-Stimulation. Offene Kreise kennzeichnen individuelle Tierdaten, wobei jede Farbe jede modulierte Temperaturbedingung darstellt. Gefüllte Rauten derselben Farbe geben den Durchschnitt aller Tiere an. Gestrichelte graue Linien kennzeichnen 95 %-Konfidenzgrenzen der Kurvenanpassung (hellblau) an gemittelte Daten. b Negative lineare Korrelation zwischen Veränderungen der evozierten Sauerstoffversorgung des Gewebes und der Größe des Anstiegs der evozierten Hbr-Konzentration („Desoxy-Dip“) über kortikale Temperaturen hinweg. c Negative lineare Korrelation zwischen Änderungen der evozierten Sauerstoffversorgung des Gewebes und dem Zeitpunkt des Einsetzens der evozierten Hbt-Reaktion. d Nichtlineare Beziehung zwischen den hervorgerufenen LFP-Reaktionen auf die 2-s- und 16-s-Whisker-Stimulation und der Stärke der maximal hervorgerufenen Hbt-Reaktion. a–c Schattierte Bereiche zeigen kühle kortikale Temperaturen an, während derer sensorische Stimulation eine vorübergehende Hypoxieperiode auslöst. b–d Datenpunkte stellen Durchschnittswerte über Tiere mit xy-Fehlerbalken als SEM dar und sind farbcodiert für jede modulierte Temperaturbedingung, wie im Schlüssel in b angegeben. Informationen zur Kurvenanpassung und zu statistischen Details finden Sie im Haupttext.

Zusammenfassend haben wir neben einer präzisen Manipulation der kortikalen Temperatur eine neuartige multimodale Methodik eingesetzt, um die räumlich-zeitliche Dynamik mehrerer neuronaler und vaskulärer Messungen während der sensorischen Verarbeitung und die Rolle der Gehirntemperatur bei deren Modulation zu untersuchen. Wir zeigen, dass Änderungen der kortikalen Temperatur sensorisch hervorgerufene neuronale und vaskuläre Reaktionen auf nichtlineare Weise (teilweise umgekehrte U-Form) tiefgreifend modulieren, wobei insbesondere die Kühlung des Gehirns neuronale und vaskuläre Reaktionen erheblich dämpft und die neurovaskuläre Kopplung, wie z. B. Sauerstoff, verzögert wird extrahiert, bevor sich die Gefäße zu erweitern beginnen, was zur Entstehung einer vorübergehenden Gewebehypoxie und einem starken frühen Anstieg des Hbr (dem „Desoxy-Dip“) führt. Der Anstieg der Gehirntemperatur über den Kern war wiederum mit einer moderaten Abschwächung und einer schnelleren Dynamik neuronaler und vaskulärer Reaktionen sowie dem Auftreten einer faszinierenden, aber deutlich zu beobachtenden niederfrequenten Oszillation bei hämodynamischen Messungen verbunden.

Perfusionsbezogene Bildgebungstechniken wie BOLD fMRI liefern keine Aussage über zugrunde liegende Veränderungen der neuronalen Aktivität, sondern liefern vielmehr hämodynamische Ersatzmessungen als Ergebnis einer (angenommenen linearen) neurovaskulären Kopplung. Dies unterstreicht die Bedeutung eines vollständigen mechanistischen Verständnisses dieses biologischen Prozesses für die genaue Interpretation solcher Neuroimaging-Signale. Eine erste Beobachtung auf diesem Gebiet war die eines frühen Anstiegs des Desoxyhämoglobins (Hbr), eines „Desoxy-Einbruchs“, während der sensorischen Verarbeitung, der eine genauere Kartierung aktiver Regionen im Gehirn versprach, da erwartet wurde, dass er einen frühen Fokus erzeugt negatives BOLD-Signal vor der anschließenden Hbr-Auswaschung (die das kanonisch positive BOLD-Signal aufgrund funktioneller Hyperämie untermauert) in Drainagevenen, die räumlich von der Stelle der neuronalen Aktivierung entfernt sind29. Die Gültigkeit des „Desoxy-Dip“ bleibt jedoch heftig umstritten, da Gruppen, darunter auch unsere, von seinem Vorhandensein berichten30,31,32,33 und andere es nicht beobachten34, mit der Vermutung, dass es sich möglicherweise um ein Artefakt der verwendeten optischen Bildgebungsalgorithmen handelt um remittiertes Licht in Änderungen der Hämoglobinkonzentration umzuwandeln35,36. Unsere Ergebnisse, die darauf hinweisen, dass kühlere kortikale Temperaturen mit dem Vorhandensein eines „Desoxy-Dip“ verbunden sind, bringen möglicherweise diese historische Debatte auf diesem Gebiet in Einklang und legen nahe, dass die unterschiedlichen Ergebnisse möglicherweise auf unterschiedliche kortikale Temperaturen als Ergebnis unterschiedlicher experimenteller Methoden zurückzuführen sind. z. B. freigelegte Dura im Vergleich zu verdünnten Schädelfensterpräparationen, Laborumgebung, Anästhesieregime und -dauer37 und sogar das Wasser für Immersionsobjektive38.

Was die therapeutischen Auswirkungen anbelangt, verringert die hier angewandte fokale Kühlung des Gehirns auf ähnliche Temperaturen das Risiko einer epileptischen Aktivität während der Operation, die sich bei der Durchführung einer intraoperativen Funktionskartierung mithilfe elektrischer Stimulationsmethoden manifestieren kann39. Es wurde jedoch festgestellt, dass die intraoperative fokale Kühlung bestimmter Hirnregionen während der Ausführung von Stimmsequenzen bei wachen neurologischen Patienten an sich eine funktionelle Trennung kortikaler Bereiche ermöglicht, die dem Sprachtiming und der Artikulation zugrunde liegen, und dabei hilft, kritische Sprachzentren während der chirurgischen Resektion zu vermeiden40. Kürzlich wurde auch berichtet, dass die intraoperative direkte fokale Kühlung des Gehirns unter Verwendung eines ähnlichen PID-gesteuerten Systemansatzes und einer ähnlichen Zieltemperatur wie in unserer Studie die Sprachkartierung durch Überwachung thermischer Veränderungen aufgrund funktioneller Hyperämie ermöglichte41 (und siehe Abb. 1e in das aktuelle Manuskript). Da intrinsische optische Bildgebungsspektroskopie (OIS)-Methoden, die mit den hier verwendeten identisch sind, auch erfolgreich im Operationssaal implementiert wurden42,43,44,45 und aufgrund unserer Beobachtung eines „Desoxy-Dip“ während der sensorischen Verarbeitung bei kühlen kortikalen Temperaturen Das ist räumlich am Ort der neuronalen Aktivierung lokalisiert (siehe oben). Es ist daher verlockend zu spekulieren, dass die Kombination aus fokaler Kühlung und intraoperativem OIS nicht nur das Risiko epileptiformer Aktivität während der damit verbundenen funktionellen Kartierung verringern, sondern auch die Kartierung verbessern würde Genauigkeit.

Im Gegenzug machten wir eine faszinierende Beobachtung einer anhaltenden niederfrequenten Oszillation (0,05–0,25 Hz) bei hämodynamischen Messungen mit kortikalen Temperaturen, die deutlich über dem Kernniveau liegen. Bei der zerebralen Vasomotion handelt es sich um eine seit langem beobachtete, aber zunehmend geschätzte Gefäßoszillation46,47,48, deren Ätiologie und Funktion (oder tatsächlich Merkmale) weiterhin umstritten sind, die jedoch in von Ratten abgeleiteten hämodynamischen Daten die Form eines schmalbandigen Peaks mit der Mitte bei 0,1 annimmt Hz im Frequenzspektrum unter normalen Versuchsbedingungen48. Die beobachtete Oszillation könnte daher eine deutliche Oszillation im Zusammenhang mit der Gehirnhyperthermie oder möglicherweise eine höherfrequente Variante der Vasomotion widerspiegeln; In beiden Fällen muss noch bestätigt werden, ob dieses auftretende Signal pathologische Prozesse als Folge einer erhöhten kortikalen Temperatur widerspiegelt oder eine Form von Neuroprotektion vermittelt, wie dies für die Vasomotion postuliert wurde, siehe Lit. 49. Die Korrelationsanalyse deutete darauf hin, dass die beobachtete niederfrequente Schwingung möglicherweise eine neuronale unabhängige Komponente umfasst und auch mit der Burst-Unterdrückungsaktivität zusammenhängt. Dies erfordert jedoch weitere Untersuchungen. Ungeachtet dessen ist die funktionelle Nahinfrarotspektroskopie (fNIRS) eine Technik, die einen analogen biophysikalischen Rahmen wie OIS hat (wie hier verwendet, einfach bei relativ kürzeren Wellenlängen), und angesichts des Werts von fNIRS für die nicht-invasive Überwachung von Neugeborenen/Säuglingen50, Es ist wiederum verlockend zu spekulieren, dass die beobachtete Oszillation ein nützlicher funktioneller Marker für die Hyperthermie des Gehirns während der Entwicklung sein könnte, der durch fNIRS nicht-invasiv nachweisbar ist, insbesondere da sich die pathologische Hyperthermie des Gehirns möglicherweise nicht genau in den Messungen der Körperkerntemperatur widerspiegelt51.

Wir haben nicht nur eine umgekehrt U-förmige krummlinige Beziehung zwischen kortikaler Temperatur und neurovaskulärer Kopplung aufgedeckt, was auf ein optimales Temperaturfenster für die Funktion hindeutet und Auswirkungen auf die Interpretation von BOLD-fMRT-Signalen hat (siehe auch unsere vorherige Arbeit17), sondern auch die faszinierende Beobachtung gemacht, dass maximale sensorische Die hervorgerufenen neuronalen und hämodynamischen Reaktionen traten bei kortikalen Temperaturen von etwa 29 °C auf (Abb. 2 und 3). Die Bedeutung dieses Effekts bleibt unklar, kann aber darauf zurückzuführen sein, dass Nagetiere über Gehirne mit einem hohen Verhältnis von Oberfläche zu Volumen verfügen, die besonders anfällig für den Wärmeaustausch mit der Außenumgebung sind und im Gegensatz zum Menschen negative Unterschiede in der Gehirn-Kern-Temperatur aufweisen52. Mechanistisch gesehen waren moderate kortikale Temperaturen mit einer Verbreiterung der neuronalen Reaktion verbunden und deuteten auf eine Verringerung der Feedforward-Hemmung hin. Bei erhöhten Temperaturen war das Gegenteil der Fall, wobei das neuronale Feuern schnell reduziert wurde, was auf eine verstärkte neuronale Hemmung hindeutet. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass kortikale Interneurone im Vergleich zu erregenden Neuronen/Erregung möglicherweise stärker von Temperaturschwankungen betroffen sind53,54 und eine Schlüsselrolle bei der Gestaltung der BOLD-Signaldynamik spielen55,56,57. Daher wird es für weitere Forschungen interessant sein, herauszufinden, ob andere Zellen, die Teil der neurovaskulären Einheit sind, nämlich Astrozyten und Perizyten, ebenfalls ähnlich anfällig für Änderungen der kortikalen Temperatur sind.

Pharmakologische Manipulationen zur Untersuchung der neurovaskulären Kopplung haben wichtige Beiträge zu unserem Verständnis der mechanistischen Wege und Zelltypen geleistet, die an diesem kritischen homöostatischen Prozess beteiligt sind. Hier stellen wir durch Modulation der Gehirntemperatur eine alternative elementare, aber granulare Methode vor, um die evozierte kortikale Verarbeitung systematisch zu verändern und ihre Auswirkungen auf die neurovaskuläre Kopplung zu bewerten, wodurch potenzielle Off-Target-Effekte umgangen werden. Mit diesem Ansatz zeigen wir, dass bidirektionale Änderungen der kortikalen Temperatur die neuronalen und vaskulären Reaktionen während der sensorischen Verarbeitung deutlich verändern. Unsere Ergebnisse haben wichtige Auswirkungen auf die Interpretation funktioneller Daten aus In-vivo-Experimenten, bei denen die lokale Temperatur des Hirngewebes durch die verwendeten Techniken (z. B. optogenetische Stimulation, Laserbeleuchtung und Anästhesieregime) über die Normothermie hinaus verändert wird37,38,58,59. Darüber hinaus können unsere Ergebnisse in aufkeimende klinische Methoden einfließen, die die fokale Hirnkühlung bei den hier untersuchten Temperaturen nutzen, unter anderem zur chronischen und intraoperativen Unterdrückung epileptischer Aktivität und funktioneller Kartierung39,40,41,60,61, und außerdem Einblicke in potenzielle pathologische Prozesse in der Neurologie liefern Bedingungen, bei denen die Gehirntemperaturen die Kernwerte um bis zu mehrere °C übersteigen62,63,64. Ungeachtet dessen stammen unsere Daten aufgrund der invasiven Natur und der technischen Herausforderungen dieser Temperaturmodulationsexperimente vom anästhesierten Nagetier und umfassen thermische Extrema, die unter normalen physiologischen Bedingungen nicht auftreten würden. Faktoren wie anästhesiebedingte Störungen und unterschiedliche intrinsische Gehirnthermodynamik bei Nagetieren im Vergleich zu Menschen sind daher wichtige Überlegungen bei der Interpretation unserer Ergebnisse. Während es derzeit nicht praktikabel ist, solche Experimente am Menschen zu rekapitulieren, könnten technologische Entwicklungen dies in Zukunft bei intraoperativen Eingriffen in geeigneten Kohorten ermöglichen und eine Validierung unserer präklinischen Ergebnisse ermöglichen.

Chirurgische und experimentelle Verfahren wurden vom britischen Innenministerium gemäß dem Animal (Scientific procedure) Act 1986 reguliert. Sechs weibliche Hooded-Lister-Ratten mit einem Gewicht zwischen 230 und 330 g wurden in einer temperaturkontrollierten Umgebung (20–22 °C) gehalten. unter einem 12-Stunden-Dunkel/Hell-Zyklus. Futter und Wasser wurden nach Belieben bereitgestellt. Die Tiere wurden mit 1,25 g/kg Urethan ip anästhesiert, wobei bei Bedarf zusätzliche Dosen (0,1 ml) verabreicht wurden. Es wurde gezeigt, dass eine Urethananästhesie sowohl die erregende (Glutamat-vermittelte) als auch die inhibitorische (GABA-A- und GABA-B-vermittelte) synaptische Übertragung aufrechterhält. Dies steht im Gegensatz zu vielen Allgemeinanästhetika, von denen angenommen wird, dass sie die GABAerge Übertragung verstärken und/oder die glutamaterge Übertragung hemmen65,66,67,68. Aufgrund der invasiven Natur des Temperaturmodulationsansatzes sowie der Möglichkeit, bei erhöhten kortikalen Temperaturen, wenn die Tiere bei Bewusstsein waren, Fieberkrämpfe auszulösen, wurden die Experimente unter Endanästhesie durchgeführt. Atropin wurde in einer Menge von 0,4 mg/kg s.c. verabreicht, um die Schleimsekretion während der Operation zu verringern. Die Kerntemperatur wurde während der chirurgischen und experimentellen Eingriffe mithilfe eines homöothermischen Heizdeckensystems mit rektaler Temperaturüberwachung (Harvard Instruments, Edenbridge, UK) auf ~37 °C gehalten. Die Tiere wurden tracheotomiert, um eine kontrollierte Beatmung und eine kontinuierliche Überwachung des endexspiratorischen CO2 zu ermöglichen (CapStar-100, CWE Systems, USA). Der systemische pCO2-Wert und die Sauerstoffsättigung wurden durch die Anpassung der Beatmungsparameter anhand der arteriellen Blutgasmessungen innerhalb physiologischer Grenzen gehalten. Die Oberschenkelvene und -arterie wurden mit einer Kanüle versehen, um die Messung des systemischen arteriellen Blutdrucks (MABP) bzw. der Arzneimittelinfusion zu ermöglichen. Der MABP wurde durch eine Infusion von Phenylephrin mit 0,13–0,26 mg/h zwischen 100–110 mmHg gehalten69,70. Zum Halten des Subjekts wurde ein stereotaktischer Rahmen (Kopf Instruments, Kalifornien, USA) verwendet. Der Schädel wurde freigelegt und ein Bereich des Schädels, der über dem rechten somatosensorischen Kortex lag, wurde mit einem Zahnbohrer bis zur Transluzenz ausgedünnt. Zur Kühlung der kortikalen Oberfläche während des Bohrens wurde sterile Kochsalzlösung verwendet. Anschließend wurde eine kreisförmige Kunststoffkammer und Spule zur kortikalen Temperaturmodulation (unten beschrieben) mit Zahnzement am Schädel befestigt.

Um Elektroden und Temperatur-/Sauerstoffsensoren im Whisker-Barrel-Cortex zu platzieren, führten wir zunächst eine kurze 2-sekündige Whisker-Stimulation durch, um den aktiven Bereich zu lokalisieren. Zwei Stimulationselektroden aus rostfreiem Stahl, die bis auf 2 mm von der Spitze isoliert waren, wurden subkutan in einer anterior-posterioren Ebene in das linke (kontralaterale) Whisker-Pad eingeführt. Die Elektroden wurden jeweils zwischen den Reihen A/B und C/D platziert; um sicherzustellen, dass das gesamte Whisker-Pad stimuliert wurde, wenn elektrische Impulse angelegt wurden. Diese elektrischen Reize führten zu keinen Veränderungen der gemessenen systemischen Physiologie (MABP, Herzfrequenz oder endexspiratorischer pCO2). Das 2-s-Whisker-Experiment wurde mit 2D-OIS durchgeführt und bestand aus 30 Versuchen mit einer Dauer von 25 s mit einer 2-s-Stimulation bei 5 Hz und einer Basisperiode von 5 s in jedem Versuch. Die Daten wurden dann gemittelt und der unten beschriebenen Spektroskopieanalyse unterzogen, um mikromolare Änderungen des Hbt im Laufe der Zeit zu erzeugen.

Die Bilder wurden analysiert, um eine zeitlich gemittelte räumliche Karte von Hbt während der Stimulation zu erstellen. Mithilfe einer automatisierten Bildsegmentierungsanalyse wurde die Grenze ermittelt, die den primären Bereich umgibt, der einen Anstieg von Hbt aufweist. Die Grenze wurde einem Kamerareferenzbild überlagert, das das Oberflächengefäßsystem zeigt (siehe Abb. 1b). Für die Platzierung der Sonden wurden Regionen in der Mitte der aktivierten Whiskerfässer mit minimalem Oberflächengefäßsystem ausgewählt, um Blutungen bei der Implantation zu verhindern. Die Position der Elektrode hatte Vorrang vor der Temperatur-/Sauerstoffsonde. In den verbleibenden Schädel, der über jeder ausgewählten Region lag, wurde ein kleines Loch gebohrt und die Dura mit einer feinen Nadel durchstochen. Die 16-Kanal-Linear-Array-Elektrode (177 µm2 Standortfläche, 100 µm Abstand, Neuronexus Technologies, USA) wurde an einem stereotaktischen Arm (Kopf Instruments, USA) befestigt und normal zur kortikalen Oberfläche bis zu einer Tiefe von etwa 1500 µm eingeführt. Eine Mehrfachsonde (zur Messung der Gewebesauerstoffversorgung und -temperatur, siehe unten) wurde ebenfalls an einem sekundären stereotaktischen Arm befestigt und mithilfe stereotaktischer Manipulation unter einem Mikroskop normal bis zu einer Tiefe von 500 µm in die kortikale Oberfläche eingeführt (Beispiele siehe Abb. 1b). von Elektrode und Sonde, die in der Whisker-Barrel-Kortex platziert werden). Anschließend wurde sterile Kochsalzlösung in die Vertiefung gegeben und teilweise mit einem Glasdeckglas abgedeckt, um eine stabile Bildgebung bei allen Verfahren und Änderungen der Kammerflüssigkeitstemperatur zu gewährleisten.

Es wurde ein neuartiges System entwickelt, um die kortikale Oberflächentemperatur einer anästhesierten Ratte feingesteuert zu modulieren (Abb. 1a). Das System nutzte zwei mit Flüssigkeit gefüllte Behälter, um entweder erhitztes (50 °C) oder gekühltes (<1 °C) destilliertes Wasser bereitzustellen. Für die erhitzte Wasserkomponente wurde ein temperaturgesteuertes Heißwasserbad (StableTemp 5 Liter, Cole-Parmer UK) verwendet, das auf 50 °C eingestellt war. Die gekühlte Wasserkomponente bestand aus einem 3-l-Kunststoffbehälter, der mit einer 50/50-Mischung aus Eis und destilliertem Wasser gefüllt und zur Isolierung in einer Styroporbox untergebracht war. Beide Reservoirs enthielten untergetauchte Thermoelemente zur Überwachung der Temperatur. Beide Reservoirs konnten sich vor der aktiven Temperaturkontrolle mindestens eine Stunde lang stabilisieren und wurden bei Bedarf mit kleinen Mengen (<10 % des Gesamtvolumens) frischem destilliertem Wasser aufgefüllt. Die Temperatur beider Reservoirs blieb während der Experimente stabil. Mikropumpen (M100S-SUB, TCS Micropumps, Kent UK) wurden in beide Reservoirs eingetaucht, wobei der Auslass jeder Pumpe an einen flexiblen Silikonschlauch mit kleinem Durchmesser angeschlossen war, der anschließend an einen Silikonschlauch mit größerem Durchmesser (6 mm Außendurchmesser, 4 mm Innendurchmesser) angeschlossen wurde. Aquariumschläuche). Die Auslassrohre der beiden Pumpen wurden isoliert und etwa 70 cm von jedem Reservoir entfernt mit einem T-Stück verbunden, das den Zufluss in die am Schädel befestigte Kammer ermöglichte. Der Innenumfang der Kammer enthielt ein Edelstahlrohr, das zu einer Spule geformt war, die für Kühlung und Erwärmung eines sterilen Salzlösungsreservoirs in der Kammer sorgte. Der Einlass zu dieser Spule wurde an einen PVC-Schlauch und dann an den kombinierten Zufluss aus den Heiß- und Kaltreservoirs angeschlossen (siehe oben). Der Auslass wurde ebenfalls an einen PVC-Schlauch angeschlossen und in einem Abflussgefäß befestigt, um das Abwasser aufzufangen. Die Oberseite der Kammer enthielt eine maschinell bearbeitete Lippe, um ein Deckglas aus Mikroskopglas aufzunehmen, mit Platz für die Mehrkanalelektrode, den Gehirntemperatur-/Sauerstoffsensor und ein separates Thermoelement, um die Temperatur des Kochsalzlösungsreservoirs in der Kammer zu messen Die Leistung des Heiz-/Kühlkreislaufs muss kontinuierlich überwacht werden.

Unsere Methode zur Kontrolle der Gehirntemperatur lieferte bemerkenswert stabile Ergebnisse. Wir führten Whisker-Stimulationen (2 und 16 s) über einen Bereich eingestellter Kammerflüssigkeitstemperaturen (Bereich 6–44 °C) durch, wodurch die kortikalen Temperaturen von 12,5 bis 39,8 °C moduliert wurden (weitere Einzelheiten finden Sie in den Ergänzungstabellen 1 und 2). Der Unterschied zwischen Kammertemperatur und Gehirntemperatur spiegelt die dynamische Natur des Gehirns wider, bei dem der Zufluss von Blut mit Kerntemperatur je nach Gehirntemperatur entweder einen Kühl- oder Heizeffekt bewirkt.

Aufgrund der bei Temperatursystemen üblichen inhärenten Zeitverzögerungen ist eine genaue Temperaturregelung oft schwierig. Das Regelungsproblem wurde hier durch ein kleines zu regelndes Flüssigkeitsvolumen, einen breiten Bereich erforderlicher Sollwerte (6 bis 44 °C) über und unter der Raum- und Probandentemperatur, schnelle Übergangszeiten beim Temperaturwechsel und minimale Stetigkeit verschärft -State-Fehler. Daher war ein mehrstufiger Ansatz mit feiner Steuerung des Flüssigkeitsflusses erforderlich. Die Steuerungssoftware und Benutzeroberfläche der obersten Ebene wurden in LabVIEW (National Instruments, Texas, USA) geschrieben, was eine bidirektionale Kommunikation zwischen dem Steuerungs-PC und der Temperaturerfassungs- und Pumpensteuerung ermöglichte. Die Temperaturen wurden mithilfe von Thermoelementen (Typ K, Pico-Technologie) aufgezeichnet, die in die Kammer sowie in Warm- und Kaltwasserreservoirs eingetaucht waren. Diese wurden an einen Datenlogger (TC-08, 8-Kanal-Datenlogger, Pico Technologies, Cambridgeshire) angeschlossen, der bis zu 1 kHz abtastete und über USB mit dem PC verbunden war. Ein Software Development Kit (SDK) wurde verwendet, um den Datenlogger mit LabVIEW zu verbinden (PicoSDK 10.6.12, Pico Technology).

Der Pumpensteuerungsausgang von LabVIEW wurde über eine benutzerdefinierte RS232-Schnittstelle mit einem programmierbaren Mikroprozessor (Arduino UNO R3, Arduino Italien) verbunden, der eine programmgesteuerte Auswahl der Pumpe (heiß oder kalt) und der Pumpengeschwindigkeit in einem Bereich von –255 (am kältesten) ermöglichte. bis +255 (am heißesten). In LabVIEW wurde ein Proportional-Integral-Derivativ-Regelungssystem (PID) entwickelt. PID bietet eine kontinuierliche Systemsteuerung durch die Anpassung einer manipulierten Variablen (MV), um einen Fehlerwert zu minimieren, der sich aus der Differenz zwischen dem gewünschten Wert (Sollwert, SP) und einem gemessenen Wert (Prozessvariable, PV) ergibt. Hier ist SP die gewünschte Temperatur (6 bis 44 °C), PV die Temperatur, die am im Bohrloch eingetauchten Thermoelement gemessen wird, und MV die Pumpenquelle und -leistung. Die drei Komponenten des PID bieten verschiedene Steuerungsaspekte, die individuell auf das zu steuernde System und die erforderlichen Leistungsmerkmale abgestimmt werden können. Proportional-, Proportional-Integral- und PID-Regler wurden implementiert und manuell eingestellt, konnten jedoch keine stabile Bohrlochtemperatur aufrechterhalten. Daher wurden weitere Regelschritte eingebaut, um die Reglerfunktion zu verbessern. Beim ersten wurde die Tiefpassfilterung des PV-Eingangs zu einer abgeleiteten Komponente des Reglers hinzugefügt, um Rauscheffekte durch die PV-Temperaturabtastung zu reduzieren. Die zweite Möglichkeit, die PID-Verstärkungsplanung, wurde integriert, um die Reglerverstärkungsparameter zu ändern, wenn die Temperatur innerhalb von 1 °C vom SP lag. Dies ermöglichte eine aggressivere Steuerung der Temperatur, wenn große Änderungen des SP erforderlich waren, während langsamer wirkende Parameter verwendet wurden, wenn der Fehlerterm minimal war, z. B. SP nahe PV. Das Hardware-Design ermöglichte auch eine stabilere Softwaresteuerung, insbesondere bei großen SP-Änderungen, wie z. B. minimalem Pumpen, isolierten Rohrleitungen, Einweg-Rückschlagventilen und minimaler Rohrlänge zwischen T-Stück und Bohrloch. Die Kühlsteuerungshardware (Arduino) empfing bei jedem Beginn der Stimuluspräsentation 5-V-TTL-Impulse von der CED-Datenerfassungshardware, die über RS232 an LabVIEW weitergeleitet wurden. Die Synchronisationsimpulse wurden zusammen mit den Aufzeichnungen der Bohrlochtemperatur und der Prozesskontrollparameter aufgezeichnet, was einen späteren Vergleich mit den anderen multimodalen Neuroimaging-Methoden ermöglicht. Das daraus resultierende Temperaturkontrollsystem sorgte für Stabilität bei konstanter Temperatur und eine schnelle Änderung (weniger als zwei Minuten) auf die neue Solltemperatur bei Bedarf.

Die zweidimensionale optische Bildgebungsspektroskopie (2D-OIS) liefert räumlich-zeitliche Messungen der kortikalen Hämodynamik. Die Oberfläche des Kortex wurde in einer sich wiederholenden Reihenfolge mit Licht vier Wellenlängen beleuchtet, wobei eine CCD-Kamera (1M60, Teledyne Dalsa, Kanada) zur Aufzeichnung des remittierten Lichts verwendet wurde. Die Kamera arbeitete mit 4 × 4 Pixel-Binning, wobei jedes Bildpixel 75 × 75 µm der kortikalen Oberfläche repräsentierte. Die Quanteneffizienz der Kamera betrug 28 % bei 500 nm. Die Beleuchtung und Wellenlängenumschaltung erfolgte durch einen Hochgeschwindigkeitsfilterwechsler Lambda DG-4 (Sutter Instrument Company, Novato, Kalifornien, USA). Die vier Wellenlängen wurden als zwei spezifische Paare ausgewählt (494 nm ± 31 FWHM und 560 nm ± 16 FWHM; 575 nm ± 14 FWHM und 595 nm ± 9 FWHM). Die für jedes Paar ausgewählten Wellenlängen hatten ähnliche Gesamtabsorptionskoeffizienten und erfassten somit das gleiche Gewebevolumen. Die spezifischen Absorptionskoeffizienten für Oxyhämoglobin (HbO2) und Desoxyhämoglobin (Hbr) wurden für jedes Paar so unterschiedlich wie möglich gewählt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren. Die 32-Hz-Bildfrequenz der Kamera wurde mit der Filterumschaltung synchronisiert, sodass die vier Beleuchtungswellenlängen eine effektive Bildfrequenz von 32/4 = 8 Hz erzeugten.

Die erfassten Bilder wurden analysiert, um die Änderung der Hämoglobinsättigung und -konzentration gegenüber vorgegebenen Ausgangswerten von 100 μM Konzentration und 60 % Sättigung bei Raumtemperatur abzuschätzen, basierend auf unseren früheren Beobachtungen71. Wir nutzten den Übergangszeitraum zwischen den Experimenten, in dem die Kammertemperatur auf das gewünschte Niveau angepasst wurde, um die Änderung der Hbt-Grundkonzentration und -Sättigung (siehe Tabelle unten) aufzuzeichnen und zu berechnen, um temperaturbedingte Änderungen auszugleichen. Diese Werte wurden dann als Eingaben für die spektroskopische Analyse verschiedener Temperaturexperimente verwendet.

Kammertemperatur (oC)

Hbt-Konzentration (μM)

Sättigung (%)

107

103

102

Umgebungs

100

Der Analyseansatz nutzte die wellenlängenabhängigen Absorptionsspektren von Hämoglobin mit Schätzungen der Photonenweglänge mithilfe von Monte-Carlo-Simulationen von Licht, das durch ein homogenes 3D-Gewebemodell geht, um die Photonenabsorption für jede Beleuchtungswellenlänge abzuschätzen. Die Bilder wurden Pixel für Pixel unter Verwendung eines modifizierten Beer-Lambert-Gesetzes analysiert, um die berechnete Absorption in 2D-räumlich-zeitliche Bildserien der Schätzungen der Änderungen des Gesamthämoglobins (Hbt), des Oxyhämoglobins (HbO) und des Desoxyhämoglobins (Hbr) umzuwandeln. von den Grundwerten. Die Daten wurden als gemittelte Bildkarten (in absoluten µM-Konzentrationsänderungen) oder als Zeitreihen aus einer Barrel-Cortex-assoziierten Region of Interest (ROI) als fraktionierte Änderungen gegenüber dem Ausgangswert oder in absoluten µM-Konzentrationsänderungen angezeigt. Hbt-Zeitreihendaten wurden auch im Frequenzbereich mithilfe einer kontinuierlichen Wavelet-Transformation (analytisches Morse-Wavelet mit einem Symmetrieparameter von 3 und einem Zeit-Bandbreiten-Produkt von 60) und Schätzungen des Welch-Leistungsspektrums untersucht. Die hämodynamischen Einsetzzeiten wurden mithilfe eines Standardansatzes berechnet, indem 15 und 85 % der Spitzenreaktion identifiziert und während der Anstiegsphase eine gerade Linie mithilfe linearer kleinster Quadrate zwischen diesen Punkten angepasst wurden. Der Ort, an dem die lineare Funktion die Grundlinie kreuzte, wurde als Beginn der hämodynamischen Reaktion definiert.

Die Elektrode wurde an einen Vorverstärker (Medusa Bioamp, Tucker-Davis-Technologies, USA) angeschlossen und optisch mit einem Datenerfassungssystem (RZ5, Tucker-Davis-Technologies, USA) verbunden. Die Daten wurden von 16 Kanälen mit 16 Bit und einer zeitlichen Auflösung von 24,4 kHz erfasst. Reizauslöser wurden vom Datenerfassungssystem der Hauptreizsteuerungshardware mithilfe von TTL-Impulsen aufgezeichnet, um die Ausrüstung präzise zu synchronisieren. Die Multisonde (NX-BF/OT/E pO2- und Temperatursensor, Oxford Optronix UK) wurde an ein Sauerstoff- und Temperaturüberwachungssystem (OxyLite Pro, Oxford Optronix UK) angeschlossen, das Messungen der Gewebesauerstoffversorgung (pO2) und der Temperatur mit 1 ausgibt Zeitliche Auflösung in Hz. Das Überwachungssystem war mit einem Datenerfassungssystem (CED1401, Cambridge electronic design, UK) verbunden, das während der Experimente kontinuierlich pO2 und Temperatur aufzeichnete. Nach Bestätigung der guten Physiologie des Probanden und der Sondenplatzierung wurde nach 30 Minuten mit den experimentellen Aufzeichnungen begonnen, um eine Stabilisierung zu ermöglichen. Die von der Elektrode und der Multisonde erfassten Daten wurden mithilfe benutzerdefinierter Skripte in MATLAB (MathWorks, USA) konvertiert und analysiert.

Alle Stimulationsversuche wurden gemittelt, um aus jedem Stimulationsexperiment einen mittleren neuronalen Versuch zu erstellen. LFP-Daten, die die synaptische Aktivität und die intrakortikale Verarbeitung darstellen, wurden über alle Elektrodenkanäle oder als gemittelte Zeitreihe aus Tiefen von 400–900 µm (Kanäle 5:10) angezeigt, um die Reaktionen der körnigen Schichten im Barrel-Cortex zu zeigen. Um das Ausmaß der Burst-Unterdrückungsaktivität für jede Temperaturbedingung zu quantifizieren, haben wir die gesamten verketteten LFP-Zeitreihen aus Tiefen von 400–900 µm extrahiert, den Mittelwert subtrahiert und gemittelt und das Signal einer Vollwellengleichrichtung unterzogen. Das Signal wurde dann mit einer Gaußschen Funktion von 0,025 ms gefaltet, wobei als Unterdrückungsperioden solche erkannt wurden, die länger als 0,15 s waren und in denen die absolute Spannungsänderung 25 μV nicht überschritt. Die Gesamtzeit, die während des Experiments in einem Unterdrückungszustand verbracht wurde, wurde dann als Bruchteil der gesamten Versuchszeit berechnet, um das Burst Suppression Ratio (BSR) zu ermitteln.

Rohe LFP-Daten wurden über 300 Hz hochpassgefiltert, um niederfrequente Signale zu entfernen. Die Daten wurden in zeitliche 1-ms-Bins (jeweils mit 24 Proben) aufgeteilt und die Multi-Unit-Aktivität (MUA) wurde als Schwellenwert identifiziert, der 1,5 Standardabweichungen über der mittleren Basislinie liegt. Die Ergebnisse werden als Spitzen pro Millisekunde angezeigt, entweder als Funktion aller aufgezeichneten Tiefen oder als gemittelte Zeitreihe aus Tiefen von 400–900 µm (Kanäle 5:10), um Daten aus körnigen Schichten darzustellen.

Nachdem die Elektroden und Sensoren positioniert waren und sich das Subjekt mindestens 30 Minuten lang stabilisieren konnte, wurden zwei Stimulationsexperimente bei jeder eingestellten Temperatur durchgeführt. eine kurze 2 s lange Whisker-Stimulation (5 Hz, 0,8 mA, Impulsbreite 0,3 ms, 30 Versuche, 25 s Dauer mit 5 s Grundlinienperiode) und eine verlängerte 16 s lange (5 Hz, 0,8 mA, Impulsbreite 0,3 ms, 30 Versuche), 96 s Dauer mit 10 s Basisperiode) Whisker-Stimulation. Neben der Datenerfassung während der Stimulationsprotokolle bei unterschiedlichen Kammertemperaturen wurden auch Daten während Übergangsperioden zwischen den unterschiedlichen Kammertemperaturen erfasst, um die Berechnung von Änderungen der Grundlinie zu ermöglichen. Die Kammertemperatur wurde nacheinander in der folgenden Reihenfolge geändert, um die Berechnung von Änderungen der hämodynamischen Basismetriken aus den anfänglichen Umgebungsbedingungen (für die Basisdaten zur Hämoglobinkonzentration und -sättigung vorliegen, siehe oben) zu ermöglichen, die Konsistenz aufrechtzuerhalten und Aufzeichnungen durchzuführen bei erhöhten Temperaturen am Ende jedes Tierversuchs, bei dem es zu Zellschäden kommen könnte: Kammertemperatur = Umgebung → 20 °C → 10 °C → 6 °C → 37 °C → 40 °C → 44 °C.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in der aktuellen Studie verwendeten Datensätze sind im DRYAD-Repository verfügbar, https://doi.org/10.5061/dryad.n2z34tmzq.

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Diese Arbeit wurde vom UK Medical Research Council (Grant No. MR/M013553/1, JB, LWB) und Epilepsy Research UK (Grant No. P1501, JB, SSH) unterstützt. SSH wird vom UK Dementia Research Institute unterstützt, das seine Mittel von DRI Ltd erhält, finanziert vom Medical Research Council, der Alzheimer's Society und Alzheimer Research UK. SSH wird außerdem durch einen Preis des britischen DRI-Pilotstudienprogramms unterstützt. CH wird durch ein Sir Henry Dale Fellowship finanziert, das gemeinsam vom Wellcome Trust und der Royal Society finanziert wird. Diese Forschung wurde ganz oder teilweise vom Wellcome Trust [Grant-Nummer 105586/Z/14/Z] finanziert. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben. Wir danken dem technischen Personal des Fachbereichs Psychologie der University of Sheffield, insbesondere Michael Port, für seine Unterstützung beim Aufbau des Temperaturkontrollsystems.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Luke W. Boorman, Samuel S. Harris.

Institut für Psychologie, University of Sheffield, Sheffield, Großbritannien

Luke W. Boorman, Osman Shabir, Llywelyn Lee, Beth Eyre, Clare Howarth und Jason Berwick

UK Dementia Research Institute am University College London, University College London, London, Großbritannien

Samuel S. Harris

Abteilung für Infektionsimmunität und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, University of Sheffield, Sheffield, Großbritannien

Osman Shabir

Neurowissenschaftliches Institut, University of Sheffield, Sheffield, Großbritannien

Osman Shabir, Llywelyn Lee, Beth Eyre, Clare Howarth und Jason Berwick

Healthy Lifespan Institute, University of Sheffield, Sheffield, Großbritannien

Osman Shabir, Llywelyn Lee, Beth Eyre, Clare Howarth und Jason Berwick

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Alle Autoren haben zur Konzeption und Gestaltung der Studie beigetragen. Die Materialvorbereitung, Datenerfassung und Analyse wurden von LWB, SSH und JB durchgeführt. Der erste Entwurf des Manuskripts wurde von JB und SSH verfasst, und OS, LL, BE und CH lieferten kritische Überprüfungen, Kommentare und Überarbeitungen zu allen Versionen des Manuskripts. CH und JB stellten Ressourcen bereit und verwalteten das Projekt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jason Berwick.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Cam Ha Tran und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin: Karli Montague-Cardoso. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Boorman, LW, Harris, SS, Shabir, O. et al. Bidirektionale Veränderungen der Gehirntemperatur modulieren in vivo tiefgreifende räumlich-zeitliche neurovaskuläre Reaktionen. Commun Biol 6, 185 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04542-6

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Eingegangen: 15. Juli 2022

Angenommen: 31. Januar 2023

Veröffentlicht: 17. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04542-6

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